伯小远经常收到同学咨询如何检测过表达/突变体株系的问题，今天小远就再来分享一下吧。
检测过表达株系
PCR检测真核抗性基因or目的基因
对聚合酶链式反应（Polymerasechainreaction，PCR），咱就不多说了，每个进入分子实验室的同学最先接触的实验除了提质粒，那就是PCR啦。
检测过表达株系，可以检测两类基因：（1）真核抗性基因，常见的是潮霉素磷酸转移酶基因（HptII）、草丁膦乙酰转移酶基因（Bar）、新霉素磷酸转移酶基因（NPTII）等，这些基因序列固定，每个实验室估计都有固定的、“传承”下来的引物序列；（2）目的基因，在T-DNA上设计一条引物，在目的基因上设计另一条引物，用这两条引物来进行PCR扩增。
图1PCR体系。PCR反应体系由DNA模板、引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶和PCR反应缓冲液组成。PCR反应在PCR仪中通过控制反应体系的温度来实现。
图2PCR的扩增过程。PCR包含下列三步反应：变性（denaturation）、退火（annealing）、延伸（elongation），此三步反应为一个循环，如此反复循环可以使DNA以指数形式进行扩增。
举例图3琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物(Zhouetal.,)。除了7、12、94号株系外，所有的转基因株系都扩增出了Bar基因bp的条带。
荧光定量PCR检测mRNA的相对表达量
PCR扩增是一种指数扩增，理想状态下，当把PCR终点的判断信号固定成一个统一的值（即荧光阈值），那么循环数与起始浓度的对数就是线性关系，这就是荧光定量PCR（QuantitativeReal-timePCR，qRT-PCR）相对定量的基本原理。
检测过表达株系，可以先提取目标株系的总RNA，然后将RNA逆转录成cDNA，通过qRT-PCR实验检测靶标的相对表达量。当然，一个内参基因和一个对照样本也是实验中必要的。再利用??Ct法即2-([Ct（样品基因)-Ct(样品内参基因)]–[Ct（对照目的基因)-Ct(对照内参基因)])计算过表达株系目的基因的转录水平变化。有的实验室可以用软件直接生成相对表达量的柱状图，有的实验室也有固定的、“传承”下来的Excel表格可用来计算数据，再根据数据做图。
当然，大家也别忘记，qRT-PCR技术也可用于绝对定量检测、拷贝数鉴定、基因型鉴定等实验。
图4两种不同原理的荧光定量PCR扩增过程。（左）Taqman探针法：使用含有荧光基团的Taqman探针，当探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，但在进行延伸反应时，聚合酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，即每扩增一条链，就有一个荧光分子形成，因此荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。该方法可以在同一反应中进行多靶点的检测。（右）SYBRGreenI法：使用染料分子SYBRGreenI，SYBRGreenI能与DNA双链的小沟特异性的结合，游离的SYBRGreenI几乎没有荧光信号，但结合双链DNA后，其荧光信号可呈数百倍的增加。随PCR产物的增加，PCR产物与染料的结合量也增大，其荧光信号强度代表双链DNA分子的数量。
举例图5qRT-PCR检测ScCHS2、ScF3H1、ScDFR3、ScANS、ScAG、ScAGL11和ScbHLH17基因的在五个时期的相对表达量(Qietal.,)。
Westernblot检测目的蛋白
蛋白质免疫印迹实验（Westernblot）是将细胞或组织中的蛋白质通过电泳分离，从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特异性抗体检测某种抗原（目的蛋白）的一种检测实验。使用特异性抗体对样品进行着色，通过分析着色的位置和深浅获得目的蛋白在细胞或组织中表达情况的信息。
Westernblot中有两种一抗可以使用：（1）目的蛋白的特异性抗体，一般需要委托公司来生产，成本昂贵。（2）针对特定标签的标签抗体，商业化程度高、特异性强。使用这种抗体时，别忘记在构建转基因载体时，在目的蛋白的N端或C端加上标签，常见的例如His，Flag，Myc等。标签蛋白与目的蛋白就融合在一起，通过检测标签蛋白就可以来表征目的蛋白的表达情况。
图6Westernblot的实验过程。实验流程大致分为：提蛋白，蛋白含量测定，制胶，聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白样品，转膜，封闭，孵育一抗，漂洗，孵育二抗，漂洗，加入化学发光底物，胶片曝光，得到结果图。
举例图7FIE蛋白的表达量随春化时间的延长而变化(Woodetal.,)。拟南芥在16h光照/8h黑暗的正常条件下培养12d后转移至4℃培养，在培养的第0、1、8、16、32d取样检测FIE蛋白的表达情况（1-5泳道），在结束32d春化后移回正常培养条件2d后取样检测FIE蛋白的表达情况（第6泳道）。
免疫层析试纸条检测真核抗性蛋白
免疫层析试纸条是一种快速免疫分析技术，是目前常见的检测方法之一，具有操作简单、检测快速、结果易观察、样品需要量少、成本低、携带和保存方便等优点，适合现场检测及大规模筛查检测。
常见的免疫层析试纸条是基于对转基因株系中外源蛋白的检测，如Cry1Ac、Cry2A、BAR、PAT、CP4-EPSPS等蛋白。只需将植物的叶片或种子经过简单的破碎处理，就可进行检测，5-15min即可得到结果。
图8免疫层析试纸条结构(夏启玉等,)。试纸条由样品垫、结合垫、反应膜、检测线（T线）、质控线（C线）、吸收垫及背衬组成。免疫层析试纸条可分为两类，夹心法和竞争法。以胶体金夹心法为例，简单介绍一下原理：将金标抗体（Au）Ab1吸附在结合垫上，捕获抗体Ab2喷涂于T线，抗Ab1二抗喷涂于C线。待测样品通过毛细管作用向前层析，层析至结合垫上时溶解其上的金标抗体，如果样品中含有待检抗原（Ag）则会与（Au）Ab1结合，形成（Au）Ab1-Ag继续向前层析，前行到T线时被抗体Ab2捕获形成（Au）Ab1-Ag-Ab2的复合物，T线显现红色条带，过量的（Au）Ab1继续前行，在C线处被抗Ab1二抗捕获形成复合物，C线也显示红色条带，为阳性结果；若T线无条带，C线为红色条带，为阴性结果。
举例图9免疫层析试纸条检测Bar蛋白。图片来源：伯远生物转化部大豆组。鉴定结果显示全部为阳性苗噢！
TAILPCR鉴定T-DNA插入位点
T-DNA插入位点的获得对于植物功能基因组学研究及转基因植物的筛选鉴定十分重要。检测T-DNA在基因组上的插入位点，通常使用热不对称交错PCR（ThermalAsymmetricInterlacedPCR，简称TAIL-PCR），TAIL-PCR是一种用来分离与已知序列邻近的未知DNA序列的分子生物学技术(Liuetal.,,TatjanaSingeretal.,)。
TAIL-PCR技术的基本原理是利用目标序列旁的已知序列设计3个嵌套的特异性引物（简称sp1、sp2和sp3，约20bp），用它们分别和1个具有低Tm值的短的（14bp）随机简并引物（简称AD）相组合，以基因组DNA为模板，根据引物的长短和特异性的差异设计不对称的温度循环，通过分级反应来扩增特异引物。由一个特异性引物和一个简并引物相组合构成的PCR反应叫做“半特异性PCR”。这种反应会产生3种不同类型的产物：（1）由特异性引物和简并引物扩增出的产物；（2）由同一特异性引物扩增出的产物；（3）由同一简并引物扩增出的产物。在TAIL-PCR反应中，后两种非目标产物可以通过以嵌套的特异性引物进行的后续反应来消除。
图10TAIL-PCR的扩增原理。图片来源：伯远生物
